Entdeckung kleiner Moleküle, die das ungeordnete Protein p27Kip1 hemmen

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 15686 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Ungeordnete Proteine sind in biologischen Systemen weit verbreitet, sie steuern unzählige Signal- und Regulierungsprozesse und ihre Konzentration und/oder zelluläre Lokalisierung ist bei Erkrankungen des Menschen häufig verändert. Im Gegensatz zu gefalteten Proteinen gelten ungeordnete Proteine aufgrund ihrer Konformationsheterogenität und -dynamik nicht als brauchbare Angriffspunkte für Arzneimittel. Wir haben dieses Paradigma in Frage gestellt, indem wir durch NMR-basiertes Screening kleine Moleküle identifiziert haben, die spezifisch, wenn auch schwach, an den gestörten Zellzyklusregulator p27Kip1 (p27) binden. Zwei Gruppen von Molekülen, die an Stellen gebunden sind, die durch vorübergehende Cluster aromatischer Reste in p27 entstehen. Konservierte chemische Merkmale innerhalb dieser beiden Gruppen kleiner Moleküle zeigten Komplementarität zu ihren Bindungsstellen innerhalb von p27 und stellten Struktur-Aktivitäts-Beziehungen für Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und ungeordneten Proteinen her. Schließlich wirkte eine Verbindung der Cdk2/Cyclin A-Hemmfunktion von p27 in vitro entgegen und lieferte damit den prinzipiellen Beweis dafür, dass kleine Moleküle die Funktion eines gestörten Proteins (p27) durch Sequestrierung in einer Konformation hemmen können, die nicht in der Lage ist, sich zu falten und an ein natürliches Protein zu binden regulatorisches Ziel (Cdk2/Cyclin A).

Intrinsisch ungeordnete Proteine (IDPs) sind in eukaryotischen Zellen weit verbreitet und erfüllen häufig regulatorische und signalisierende Funktionen1. Als Strukturklasse unterliegen IDPs einer strengeren Regulierung als gefaltete Proteine von der Hefe bis zum Menschen2 und sind bei Überexpression anfälliger für Veränderungen des Zellphänotyps als ihre gefalteten Gegenstücke3. Daher ist die Aufrechterhaltung einer normalen gestörten Proteinhomöostase von entscheidender Bedeutung für das Zellverhalten. Den Phänotypen, die mit der Überexpression oder Hyperaktivität von Proteinen mit gefalteten Domänen einhergehen, kann durch niedermolekulare Inhibitoren beispielsweise der Enzymfunktion (z. B. Gleevec, das BCR-Abl bei chronischer myeloischer Leukämie4 hemmt) oder Protein-Protein-Wechselwirkungen (z. B. ABT-) entgegengewirkt werden. 263 und ABT-199, die BCL-2 und BCL-xL bei hämatologischen und lymphatischen Malignomen hemmen5,6). Im Gegensatz dazu stellen ungeordnete Proteine aufgrund ihrer dynamischen und heterogenen Konformation schwierige Ziele für die Hemmung durch kleine Moleküle dar. Dennoch wurden Fortschritte erzielt. Beispielsweise wurde kürzlich durch strukturelle, biochemische und funktionelle Tests gezeigt, dass ein Inhibitor der Phosphatase PTP1B (MSI-1436), dessen Rolle bei Diabetes, Fettleibigkeit und Brustkrebs bekannt ist, über einen allosterischen Mechanismus wirkt, indem er an eine gestörte regulatorische Region bindet das Enzym7. Außerdem hemmte ein kleines Molekül (YK-4-279), das an das ungeordnete EWS-FLI1-Fusionsonkoprotein bindet, das mit Tumoren der Ewing-Sarkom-Familie assoziiert ist, die direkte Bindung an RNA-Helikase A (RHA)8, einen funktionellen Partner von EWS-FLI1 in Tumorzellen8 und veränderte RHA-abhängige Proteininteraktionen und RNA-Spleißen9. Beide Verbindungen (MSI-1436 und YK-4-279) zeigten in zellulären Tests zielgerichtete Wirkungen8,9. Andere Studien haben kleine Moleküle identifiziert, die auf gestörtes cMyc10,11,12, α-Synuclein13 und Alzheimer-β-Amyloidpeptid14 abzielen. Eine aktuelle Computerstudie15 zeigte, dass ein kleines Molekül (10074-A4), von dem zuvor berichtet wurde, dass es die cMyc-Funktion moduliert,10 auf unterschiedliche Weise an verschiedene cMyc-Moleküle innerhalb eines Ensembles aus vielen ungeordneten Konformationen gebunden ist, was die Autoren dazu veranlasste, das Konzept der „Bindung von Ligandenwolken an Proteine“ vorzuschlagen Wolken". In den oben besprochenen Studien wurden kleine Moleküle, die auf ungeordnete Proteine abzielen, mithilfe verschiedener Ansätze entdeckt, darunter funktionelle Screens, In-vitro-Bindungsscreens und/oder rechnerische Screens. Das auf Kernspinresonanz (NMR) basierende Screening von kleinen Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht, sogenannten Fragmenten (siehe Abschnitt 16), die an gefaltete Proteinziele binden, ist eine bewährte Methode zur Identifizierung erster „Treffer“ im Prozess der Arzneimittelentwicklung17,18. NMR-basiertes Fragment-Screening wurde unseres Wissens jedoch nicht zur Identifizierung kleiner Moleküle eingesetzt, die an ein ungeordnetes Proteinziel binden. Hier verwendeten wir ein NMR-basiertes Screening, um Fragmentmoleküle zu identifizieren, die an das prototypische ungeordnete Protein p27Kip1 (p27; auch bekannt als CDKN1B), einen Regulator der Cyclin-abhängigen Kinasen, die die eukaryontische Zellteilung steuern, binden und dessen Funktion modulieren19.

Die Motivation, p27 ins Visier zu nehmen, war zweifach. Erstens sind die strukturellen und funktionellen Merkmale von p27 gut verstanden20,21,22,23 und stellen ein ideales Modellsystem für die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und ungeordneten Proteinen dar. Zweitens wäre die Fähigkeit, die p27-Funktion chemisch zu modulieren, in mehreren biologischen Situationen von Vorteil. Beispielsweise wird p27 bei Brustkrebs an Threonin 157 unangemessen phosphoryliert, was mit einer abnormalen zytoplasmatischen Lokalisierung und einer Hochregulierung der Zellmigration verbunden ist24,25,26,27. Die Verfügbarkeit eines kleinen Molekül-Inhibitors von p27 wäre von Vorteil, um eine abnormale Migration von Brustkrebszellen zu verhindern. Alternativ hält p27 sowohl in sensorischen als auch in nicht-sensorischen Epithelzellen des Innenohrs den Austritt aus dem Zellzyklus und die terminale Differenzierung auf28, und seine Hemmung führte zu einem Wiedereintritt in den Zellzyklus und zu einer Regeneration zur Wiederherstellung des Hörvermögens29,30. Während über kleine Moleküle berichtet wurde, die die Transkription von p27 hemmen31, haben wir hier Ansätze entwickelt, um kleine Moleküle zu identifizieren, die direkt an p27 binden und das Potenzial haben, seine Funktion in den beiden oben diskutierten zellulären Umgebungen zu verändern.

Das Ziel unserer Studien war die N-terminale Kinase-inhibitorische Domäne von p27 (p27-KID), die an nukleare Cyclin-abhängige Kinase (Cdk)/Cyclin-Komplexe, die die eukaryotische Zellteilung steuern, bindet und deren katalytische Aktivität reguliert32. p27-KID, das isoliert stark ungeordnet ist 20, 21, nimmt bei der Bindung an Cdk2/Cyclin A eine erweiterte Konformation an (Abb. 1a), die in drei funktionell unterschiedliche Unterdomänen unterteilt werden kann. Die Subdomäne D1 bindet an eine konservierte Tasche auf Cyclin A und blockiert die Substratrekrutierung33; Die Subdomäne D2 bildet bei der Bindung an Cdk2 intra- und intermolekulare (zwischen p27 und Cdk2) β-Stränge und fügt außerdem eine Helixwindung in ihre ATP-Bindungstasche ein, wodurch die Kinaseaktivität gehemmt wird34; und die Unterdomäne LH bildet eine α-Helix, die die Unterdomänen D1 und D2 verbindet. Wir stellten die Hypothese auf, dass, wenn kleine Moleküle, die an p27-KID binden, identifiziert werden könnten, diese das ungeordnete Polypeptid dazu veranlassen könnten, Konformationen anzunehmen, die für die Bindung an Cdk/Cyclin-Komplexe inkompetent sind. Wir haben diese Hypothese getestet, indem wir eine Bibliothek von Fragmentmolekülen mithilfe von NMR-Spektroskopie auf Bindung an p27-KID untersucht haben. Wir identifizierten zwei Untergruppen von Fragmentmolekülen (insgesamt 36), die unterschiedlich schwach, aber spezifisch an zwei teilweise überlappende Regionen von p27-KID banden. Aus diesen Teilmengen generierten wir dann Pharmakophormodelle, die die Identifizierung zusätzlicher kleiner Moleküle ermöglichten, die an p27-KID banden, und eine weitere Klärung der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen. Verschiedene Tests, darunter Fluoreszenzanisotropie, NMR-Spektroskopie und ein Cdk2-Kinase-Aktivitätstest, wurden verwendet, um zu zeigen, dass eines der identifizierten kleinen Moleküle die Kinase-Bindungsregion von p27 von Cdk2 verdrängte und die katalytische Aktivität von Cdk2 teilweise wiederherstellte. Darüber hinaus lieferten molekulardynamische Berechnungen Einblicke in die dynamische „Struktur“ der Region von p27, auf die kleine Moleküle abzielen. Unsere Ergebnisse liefern Einblicke in die Natur der Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und einem ungeordneten Protein und zeigen, dass solche Wechselwirkungen die regulatorische Funktion eines ungeordneten Proteins verändern können.

Identifizierung zweier Gruppen kleiner Moleküle, die spezifisch an unterschiedliche, aber überlappende Regionen von ungeordnetem p27-KID binden.

(a) Struktur von p27-KID, gebunden an Cdk2/Cyclin A (PDB ID 1JSU); Die Subdomänen von p27-KID, einschließlich D1, LH, D2.1, D2.2 und D2.3, sind angegeben. (b,c) Chemische Strukturen zweier kleiner Moleküle, SJ572710 (SJ710) (b) und SJ572403 (SJ403) (c), die an p27-KID gebunden sind und Mitglieder der Gruppe 1 bzw. Gruppe 2 sind (siehe Text für Gruppe). Definitionen). (d,e) Histogramme, die einzelne Störungswerte der chemischen 1H-Verschiebung (durch Analyse von 2D-1H-15N-"In-Phase"-HSQC-Spektren) aus Titrationen der Verbindungen in (b) bzw. (c) in 15N-p27- zeigen. KIND. Der Schwellenwert für die Identifizierung spezifischer Wechselwirkungen mit p27-KID-Resten wurde als zwei Standardabweichungen über dem Durchschnitt der Störungswerte definiert (dargestellt durch eine gepunktete schwarze Linie im Diagramm). Die experimentelle spektrale Auflösung in der 1H-Dimension (2,4 Hz) wird durch die gepunktete magentafarbene Linie dargestellt. Dargestellt sind Störungen der chemischen Verschiebung für Molverhältnisse von 15N-p27-KID (100 μM) zu Inhibitoren von 1:30. (f,g) Störungen der chemischen Verschiebung des Amidprotons, aufgetragen gegen die Konzentration von SJ710 (f) bzw. SJ403 (g). Bindungsisothermen ausgewählter Reste zeigen eine spezifische Bindung zwischen p27-KID und Fragmenttreffern. Die Trajektorien der chemischen Verschiebungen (durchgezogene schwarze Linien) geben globale Dissoziationskonstanten von 4,8 ± 1,3 und 2,2 ± 0,3 mM für die Wechselwirkungen von p27-KID mit SJ710 (f) bzw. SJ403 (g) an.

Wir verwendeten eindimensionale (1D) 1H WaterLOGSY35- und STD36-NMR-Methoden, um „fragmentartige“ kleine Moleküle37,38,39 zu identifizieren, die an p27-KID banden. Fragmentmoleküle wurden entweder aus einer kommerziellen Bibliothek (1.100 Verbindungen aus der Ro3-Sammlung, Maybridge/Thermo Fisher Scientific) oder einer internen Bibliothek von 1.222 Verbindungen basierend auf der „Dreierregel“40 und anderen Kriterien (siehe Methoden) ausgewählt. Aus den jeweiligen Bibliotheken wurden jeweils zwei und sieben Moleküle identifiziert, die p27-KID binden (als „Treffer“ bezeichnet; repräsentative 1D-1H-NMR-Daten sind in der ergänzenden Abbildung 1a, b dargestellt und alle vorläufigen Treffer sind in der ergänzenden Tabelle 1a dargestellt). Bindungsstellen für diese Verbindungen wurden durch Titration in 15N-p27-KID und Analyse zweidimensionaler (2D) 1H-15N HSQC-Spektren identifiziert. Signifikante Störungen der chemischen Verschiebung (CSPs), die bei Amid-1H-Resonanzen am größten waren (siehe Methoden), wurden nur für Amidgruppen von Resten innerhalb der D2-Subdomäne von p27-KID (p27-D2) beobachtet; Acht Treffer verursachten CSPs innerhalb einer kurzen Region mit der Sequenz F87YY89 [(F, Phenylalanin; und Y, Tyrosin), genannt Unterregion D2.3; Abb. 1a, d] und ein Treffer verursachten CSPs in derselben Region sowie in zwei anderen Regionen in der Nähe der Reste W60N61 und E75WQ77 [(W, Tryptophan; N, Asparagin; E, Glutaminsäure; und Q, Glutamin), bezeichnet als sub -Domänen D2.1 bzw. D2.2; Abb. 1a,e]. Wir haben diese Moleküle als Gruppen 1 bzw. 2 bezeichnet (Abb. 1b, c); Repräsentative 1H-CSP-Histogramme sind in Abb. 1d, e dargestellt und 15N-CSPs sind in Suppl dargestellt. Abb. 2. Daten für alle anderen kleinen Moleküle sind in Suppl dargestellt. Abb. 3.

Wir analysierten die Moleküle der Gruppen 1 und 2 mithilfe von Computermodellen und identifizierten zusätzliche mögliche p27-KID-Bindungsmoleküle in den beiden Fragmentbibliotheken, die in den ursprünglichen 1D-NMR-Screenings nicht erkannt wurden. Die 1D- und 2D-NMR-Analyse dieser Moleküle führte zur Identifizierung von 15 zusätzlichen p27-D2-bindenden Verbindungen (sechs mit Gruppe-1-ähnlichen Bindungsmerkmalen und neun mit Gruppe-2-ähnlichen Merkmalen; Suppl. Abb. 3b und Suppl. Tabelle 1b). . CSPs wurden bei hohen Verbindungskonzentrationen beobachtet, was mit einer relativ schwachen Bindung an p27-D2 übereinstimmt, waren jedoch spezifisch für die angegebenen Regionen innerhalb von p27-D2 und genau reproduzierbar. Sechzehnpunktige 2D 1H-15N „in Phase“-HSQC-NMR-Titrationen von Treffern der Gruppe 1 (SJ572710, im Folgenden als SJ710 bezeichnet) und 2 (SJ572403, im Folgenden als SJ403 bezeichnet) ergeben eine konstante Konzentration von 15N-p27-KID (100). μM) lieferte interpretierbare Bindungsisothermen für spezifische Resonanzen von p27-KID; Die ermittelten Werte der Dissoziationskonstante (Kd) betrugen 4,8 ± 1,3 bzw. 2,2 ± 0,3 mM (Abb. 1f, g). Die überlagerten 2D 1H-15N HSQC-NMR-Spektren sind in Abb. 2 dargestellt.

Fragmenttreffer zeigen spezifische Interaktionen mit bestimmten Regionen innerhalb der D2-Subdomäne von p27-KID.

Überlagerte 2D-1H-15N-"In-Phase"-HSQC-NMR-Spektren, die Störungen der chemischen Verschiebung spezifischer Reste innerhalb der D2-Subdomäne von p27-KID nach der Titration der Fragmenttreffer SJ710 (a, Gruppe 1) und SJ403 (d, Gruppe 2) zeigen. Für jeden Treffer wurden insgesamt 16 Spektren aufgezeichnet. Die Konzentration von 15N-p27-KID (100 μM) wurde während der Titration konstant gehalten und die Konzentration des Inhibitors wurde von 0 (rot) bis 3 mM (blau) variiert. Alle Experimente wurden auf einem 800-MHz-Spektrometer durchgeführt und verwendeten Aufnahmeparameter, die eine spektrale Auflösung von 2,4 Hz bzw. 1,7 Hz in den 1H- und 15N-Dimensionen lieferten. Die Einschübe unten links zeigen Resonanzen für die Tryptophan-Indol-NH-Einheiten (s-W60, s-W76). (b,e) Erweiterte Regionen (blauer Kasten), die eine Teilmenge der p27-KID-Reste zeigen, die an der Interaktion mit SJ710 (b) bzw. SJ403 (e) beteiligt sind. (c,f) Erweiterte Regionen (schwarzer Kasten), die zwei der p27-KID-Reste zeigen, die bei Interaktion mit SJ710 (c) bzw. SJ403 (f) keine Störungen zeigen.

Die dreidimensionale (3D) molekulare Interaktionsfeldanalyse (siehe Abschnitt „Methoden“) identifizierte gemeinsame chemische Merkmale der beiden Gruppen von p27-D2-Bindungsmolekülen (Abb. 3a, b). Diese Analyse ergab Wechselwirkungs-„Feldpunkte“ um die kleinen Moleküle, die günstig an elektrostatischen, Van-der-Waals- und hydrophoben Wechselwirkungen teilnehmen können. Diese Feldpunkte werden zur Berechnung der molekularen Ähnlichkeit und zur Ausrichtung von Molekülen, auch solchen mit unterschiedlichen zweidimensionalen Topologien, verwendet, um ein gemeinsames Pharmakophor zu definieren.

Konsensfeldkarten für die beiden Gruppen kleiner Moleküle, die an p27-KID gebunden haben.

Blaue und rote Feldpunkte zeigen an, wo elektropositive bzw. elektronegative Gruppen im Proteinbindungspartner bevorzugt sind; Goldfeldpunkte zeigen Regionen an, in denen hydrophobe Wechselwirkungen bevorzugt sind; und gelbe Feldpunkte zeigen Regionen an, in denen günstige Van-der-Waals-Kontakte möglich sind. Die Größe des Feldpunktes nimmt mit der Größe der günstigen Wechselwirkungsenergie zu. Zwei repräsentative Moleküle aus Gruppe 1 (a) und Gruppe 2 (b) werden in Ausrichtung auf ihre jeweiligen Konsensfeldkarten dargestellt.

Die Moleküle der Gruppen 1 und 2 haben zwei oder drei heterozyklische aromatische Ringe, unterscheiden sich jedoch deutlich in der Verteilung günstiger Feldpunkte. Gruppe 1 wird hauptsächlich durch einen großen hydrophoben Kern (mehrere Goldpolygone in unmittelbarer Nähe; Abb. 3a), einen großen elektropositiven Wechselwirkungsbereich (zwei cyanfarbene Polygone in unmittelbarer Nähe) und zwei kleinere elektropositive (cyan) und elektronegative (rot) Feldpunkte definiert am gegenüberliegenden Ende des hydrophoben Kerns. Im Gegensatz dazu zeigte die Feldkarte für Gruppe 2 (Abb. 3b) einen kleineren hydrophoben Kern im Vergleich zu Gruppe 1 und zwei gleich große Bereiche mit günstiger elektropositiver Wechselwirkung. Um die Vielfalt unseres chemischen Screenings zu erweitern, verwendeten wir die Konsensfeldkarten für Moleküle der Gruppen 1 und 2, um 184 zusätzliche mögliche p27-D2-bindende Moleküle innerhalb einer Bibliothek von 10.455 im Handel erhältlichen fragmentähnlichen Molekülen zu identifizieren. Die 1D- und 2D-NMR-Analyse dieser identifizierten 12 zusätzliche p27-D2-bindende Verbindungen (8 mit Gruppe-1-ähnlichen Bindungsmerkmalen und 4 mit Gruppe-2-ähnlichen Merkmalen; Suppl. Abb. 3c und Suppl. Tabelle 1c). Diese zusätzlichen Moleküle hatten CSP-Profile, die mit den zuvor identifizierten Treffern vergleichbar waren. Um die Spezifität der Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und gestörten Proteinen weiter zu testen, haben wir festgestellt, ob die einfachen Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin an p27-KID gebunden sind. Selbst wenn jedoch mit einem 30-fachen molaren Überschuss titriert wird, verursacht keine der aromatischen Aminosäuren bei der Titration in p27-KID Störungen der chemischen Verschiebung in 2D-HSQC-Spektren (Suppl. Abb. 4). Dies ist höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass ihnen die spezifischen chemischen Merkmale fehlen, die in den Pharmakophormodellen für die beiden Gruppen von Fragmenttreffern enthalten sind.

Wir haben das Molekül der Gruppe 2, SJ403 (Suppl. Tabelle 1b), verwendet, um unsere Hypothese zu testen, dass Moleküle, die an p27 binden, seine Cdk-Regulationsfunktion verändern können. Da SJ403 schwach an p27-KID bindet, haben wir für diese Experimente seine Fähigkeit untersucht, die Bindung von p27-D2 an Cdk2/Cyclin A zu modulieren (Kd-Wert Bindung an Cdk2/Cyclin A, 73 ± 8 nM; Abb. 4a gegenüber 5). nM für p27-KID20). Wir verwendeten zunächst Fluoreszenzanisotropie (FA), um die Verdrängung einer Einzel-Cystein-Mutante (Cys) von p27-D2 aus Cdk2 zu überwachen, wobei Arginin 93 zu Cys (R93C) mutiert und mit Alexa Fluor 488 (p27-D2-FL) markiert war /cyclin A von SJ403. Die Titration von SJ403 verursachte eine konzentrationsabhängige Verringerung der FA von p27-D2-FL mit einem IC50-Wert von 475 ± 67 μM (Abb. 4b), was darauf hindeutet, dass SJ403 p27-D2 von Cdk2/Cyclin A verdrängte.

Fluoreszenzanisotropieanalyse der Verdrängung von p27-D2-FL von Cdk2/Cyclin A durch SJ403.

(a) Fluoreszenzanisotropieanalyse der Bindung von Cdk2/Cyclin A an p27-D2-FL. Die Ausgangsbedingung (20 nM p27-D2-FL, 300 nM Cdk2/Cyclin A) zur Beurteilung der Wirkung des Fragmenttreffers SJ403 auf die p27-Funktion wird als roter Kreis auf der Bindungsisotherme dargestellt. (b) Die Titration von SJ403 (0–3 mM) verursachte die Verdrängung von p27-D2 von Cdk2/Cyclin A, was zu einer Abnahme der Fluoreszenzanisotropiewerte führte. Die Experimente wurden in Dreifach- und Durchschnittswerten durchgeführt und die Standardabweichungen der Mittelwerte werden angezeigt.

Als nächstes verwendeten wir NMR-Spektroskopie, um die Verdrängung von 2H/13C/15N-markiertem p27-D2 von Cdk2/Cyclin A durch SJ403 zu überwachen; Der Komplex von p27-D2 mit Cdk2/Cyclin A (100 μM) wurde mit einem leichten Überschuss an 2H/13C/15N-p27-D2 (Molverhältnis 1,1:1,0 p27-D2:Cdk2/Cyclin A) hergestellt. Die Intensität der Peaks für ungebundenes p27-D2 nahm in Gegenwart von SJ403 dramatisch zu, während die Intensität der Resonanzen für an Cdk2/Cyclin A gebundenes p27-D2 verringert wurde (Abb. 5 und ergänzende Abb. 7a – c), was mit teilweiser Übereinstimmung übereinstimmt Verdrängung von p27-D2 von Cdk2/Cyclin A. Zur Analyse der 2D-TROSY-HSQC-NMR-Spektren wurde eine ratiometrische Methode verwendet. Bei dieser Methode wurde die relative Population der freien Zustandsresonanzen (pf; für die Resonanz jedes p27-D2-Restes) als Bruchteil der Gesamtintensität sowohl der freien als auch der gebundenen Resonanzen für einen bestimmten Rest bestimmt. Diese Werte wurden verglichen, indem das Verhältnis der beiden relativen Freistaatspopulationen (pfw/SJ403/pfw/o SJ403) gebildet wurde; Werte größer als 1 deuteten auf eine verbindungsabhängige Verschiebung hin. Die relativen Populationen für den gebundenen Zustand (pb) wurden auch für Proben ohne (pbw/o SJ403) und mit SJ403 (pbw/SJ403) bestimmt. In diesem Fall deuteten Verhältnisse von weniger als 1 auf eine Verschiebung von p27-D2 von Cdk2/Cyclin A hin. Darüber hinaus spiegelten die chemischen Verschiebungswerte der Resonanzen im freien Zustand die weitere Bindung von p27-D2 an SJ403 wider (Suppl. Abb. 7d, e). Dies stützt die Schlussfolgerung, dass SJ403 das Bindungsgleichgewicht zwischen p27-D2 und Cdk2/Cyclin A verschiebt, um die Population von ungebundenem p27-D2 durch Wechselwirkungen zwischen Protein und kleinen Molekülen zu erhöhen.

2D 1H-15N TROSY-HSQC NMR-Analyse der Verdrängung von 15N-p27-D2 von Cdk2/Cyclin A durch SJ403.

Es wurden 2D-1H-15N-TROSY-HSQC-NMR-Spektren von p27-D2/Cdk2/Cyclin A in Abwesenheit (Kontrolle) bzw. Anwesenheit von SJ403 (3 mM) aufgezeichnet. Für die angegebenen Reste wurden in den TROSY-HSQC-Spektren sowohl freie als auch gebundene p27-D2-Resonanzen beobachtet. Im TROSY-HSQC-Spektrum von p27-D2/Cdk2/Cyclin A in Gegenwart von SJ403 wurde im Vergleich zum Kontrollspektrum (a) ein Anstieg der relativen Intensität freier p27-D2-Resonanzen beobachtet, während die Resonanzen von p27 -D2, gebunden an Cdk2/Cyclin A, zeigte eine Abnahme der relativen Intensität (b). Dies ermöglicht die Berechnung von Populationen von freiem (f) und gebundenem (b) p27-D2 in Abwesenheit (ohne SJ403) und Anwesenheit von SJ403 (mit SJ403)). Die pfw/o SJ403-Werte stellen die relativen Populationen der Resonanzen für freies p27-D2 vor der Zugabe von SJ403 dar, und die pfw/SJ403-Werte sind die relativen Populationen der Resonanzen von p27-D2 im freien Zustand nach der Zugabe von SJ403. Dementsprechend stellen die pbw/o SJ403-Werte die relativen Populationen von Resonanzen für an Cdk2/Cyclin A gebundenes p27-D2 vor der Zugabe von SJ403 dar, und die pbw/SJ403-Werte sind die relativen Populationen von p27-D2-Resonanzen im gebundenen Zustand nach der Zugabe von SJ403. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der Mittelwerte für Dreifachmessungen; Ein Satz dreifacher 2D-1H-15N-TROSY-HSQC-Spektren ist in Suppl dargestellt. Abb. 7.

Die FA- und NMR-Ergebnisse zeigten, dass SJ403 p27-D2 teilweise von Cdk2/Cyclin A verdrängte; Daher untersuchten wir als nächstes, ob die Verdrängung die Kinaseaktivität von Cdk2 modulierte. Obwohl p27-D2 die in p27-KID vorkommenden D1- und LH-Subdomänen fehlen, ist es dennoch ein mäßig wirksamer Inhibitor von Cdk2/Cyclin A (IC50-Wert, 152 ± 39 nM; Suppl. Abb. 9a). Unter Bedingungen, bei denen Cdk2/Cyclin A durch p27-D2 fast vollständig gehemmt wurde (~13 % der vollen Kinaseaktivität blieben erhalten), führte die Titration von SJ403 über den in FA- und NMR-Experimenten gezeigten Konzentrationsbereich, der eine Verdrängung von p27-D2 verursachte, zu einer erhöhten Kinase Aktivität (von 13 % auf ~20 %, ein Anstieg von > 50 %; Abb. 6a und ergänzende Abb. 9b), was mit der teilweisen Verdrängung von p27-D2 aus Cdk2/Cyclin A durch SJ403 übereinstimmt. Darüber hinaus hemmte SJ403 in Abwesenheit von p27-D2 die Aktivität von Cdk2/Cyclin A erheblich bei Konzentrationen, die in Gegenwart von p27-D2 mit einer Verdrängung von p27-D2 und einer erhöhten Kinaseaktivität verbunden waren (Abb. 6b und Ergänzung 9c). . Daraus schließen wir, dass die primäre Wirkung von SJ403 die Verdrängung von p27-D2 von Cdk2/Cyclin A (durch die Bindung von SJ403 an p27-D2) und die teilweise Wiederherstellung der Kinaseaktivität ist, auch wenn eine sekundäre Wirkung von SJ403 darin besteht, die Kinase zu hemmen Aktivität (durch die Bindung von SJ403 an Cdk2/Cyclin A). Diese Ergebnisse liefern den prinzipiellen Beweis dafür, dass ein kleines Molekül (SJ403) die Funktion eines gestörten Proteins (p27-D2) durch Sequestrierung in einer Konformation hemmt, die nicht in der Lage ist, Cdk2/Cyclin A zu binden und zu hemmen.

Das kleine Molekül SJ403 verdrängt p27-D2 aus Cdk2/Cyclin A und stellt die Cdk2-Kinaseaktivität teilweise wieder her.

Analyse der Cdk2-Kinaseaktivität [innerhalb des Cdk2/Cyclin-A-Komplexes (200 pM) unter Verwendung von Histon H1 als Substrat] in Gegenwart von p27-D2 (200 nM) und unterschiedlichen Konzentrationen von SJ403 (von 10 μM bis 3 mM) (a ) und unterschiedliche Konzentrationen von SJ403 allein (b). Cdk2 ist unter den Ausgangsbedingungen in (a) teilweise aktiv und die Aktivität wird durch Zugabe von SJ403 verstärkt. In Abwesenheit von p27-D2 (b) ist die Zugabe von SJ403 mit einer Cdk2-Hemmung verbunden. Alle Experimente wurden in Dreifach- und Durchschnittswerten durchgeführt und die Standardabweichungen der Mittelwerte werden angezeigt.

Wir haben zuvor anhand von NMR- und Molekulardynamik (MD)-Rechnungsdaten gezeigt, dass p27-KID im freien Zustand verschiedene Arten teilweise besiedelter Sekundärstrukturen aufweist, einschließlich einer helikalen Struktur innerhalb der LH-Subdomäne, einer β-Haarnadelkonformation innerhalb der Subregion D2.1 und helikale Struktur innerhalb der Unterregion D2.3 der Unterdomäne D2 (Lit. 21; siehe Abb. 1a für die Nomenklatur der Unterdomänen/Unterregionen). Interessanterweise interagierten die Moleküle der Gruppen 1 und 2 unterschiedlich mit zwei dieser teilweise strukturierten Regionen von p27-KID (Unterregionen D2.1 und D2.3), aber auch mit der Unterregion D2.2, die sehr dynamisch ist und dies auch tut weisen keine persistente Sekundärstruktur21 auf (Abb. 7a – c); Diese Interaktionsstellen liegen alle innerhalb der Cdk2-bindenden D2-Subdomäne. Bemerkenswerterweise interagierten die p27-Bindungsmoleküle nicht mit den Subdomänen D1 oder LH. Wichtig ist, dass jede der Regionen innerhalb von p27-KID, die mit kleinen Molekülen interagierte, mehrere aromatische Aminosäuren enthielt (Abb. 7a). Tatsächlich enthält die Subdomäne D2 acht der neun aromatischen Aminosäuren, die in p27 vorkommen; ein neuntes, F33, befindet sich in der Subdomäne D1, bindet jedoch an kleine Moleküle. Moleküle der Gruppe 1 verursachten die größten CSPs für die Reste F87, Y88 und Y89 innerhalb der Unterregion D2.3 und Moleküle der Gruppe 2 störten die Resonanzen für diese Reste sowie für die Reste W60, N61 (Unterregion D2.1) und E75, W76 und Q77 (Unterregion D2.2). Phenylalanin- (F) oder Tyrosinreste (Y) flankieren die Tryptophanreste (W), zeigten jedoch in Gegenwart von Verbindungen der Gruppe 2 geringere CSP-Werte als die W-Reste, was darauf hindeutet, dass die kleinen Moleküle bevorzugt die elektronische Umgebung der Indolringe störten dieser Rückstände. Wir haben diese Hypothese durch Mutagenese von W60 oder W76 oder beiden innerhalb von p27-KID zu F oder Alanin (A) getestet und 2D-NMR verwendet, um die Bindung an SJ403 abzubilden. Die einfach mutierten p27-KID-Varianten zeigten ähnliche CSP-Muster wie die für Wildtyp-p27-KID beobachteten, mit der Ausnahme, dass Störungen in der Nähe der mutierten W-Reste fehlten (Suppl. Abb. 5a, b, d, e). Die beiden doppelt mutierten p27-KID-Varianten zeigten jedoch nur sehr schwache CSPs innerhalb des aromatischen F87YY89-Clusters (Suppl. Abb. 5c, f). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass jeder der beiden W-Reste, W60 und W76, wesentlich zur Bindung an SJ403 beitrug. Mutationen von F87, Y88 oder Y89 zu A waren mit wesentlich reduzierten CSPs innerhalb der Gruppe-1-Verbindungsbindungsregion von p27-KID verbunden (Suppl. Abb. 5j – l), wohingegen die Mutation von R90 zu A (Suppl. Abb. 5m) dies tat hat nur geringe Auswirkungen auf die Bindung, was bedeutet, dass die Clusterbildung der aromatischen Seitenketten für die Wechselwirkung zwischen kleinen Molekülen und Proteinen von entscheidender Bedeutung ist. Bei der Y88-zu-A-p27-KID-Mutante verursachte die Verbindung der Gruppe 2, SJ403, CSPs in der Nähe der beiden W-Reste (W60 oder W76), jedoch nicht innerhalb der F87A88Y89-Region von p27-KID (Suppl. Abb. 5h). Bei den Mutanten F87 zu A und Y89 zu A verursachte SJ403 jedoch ähnliche CSP-Muster wie bei Wildtyp-p27-KID (Suppl. Abb. 5g, i), was darauf hindeutet, dass Y88 in größerem Maße zu Wechselwirkungen mit SJ403 beiträgt (und möglicherweise andere Verbindungen der Gruppe 2) als Y89.

Kleine Moleküle binden an Cluster aromatischer Reste mit der D2-Subdomäne von p27-KID.

(a) Die Aminosäuresequenz von p27-D2 zeigt die Subdomäne D2 und die einzelnen Bindungsregionen für kleine Moleküle (beschriftet mit D2.1, D2.2 und D2.3). Die aromatischen Aminosäuren in diesen Regionen sind fett dargestellt. Diese stellen acht der neun aromatischen Reste in p27-KID dar. (b,c) Durchschnittliche 1H-Störungswerte der chemischen Verschiebung für alle Verbindungen der Gruppe 1 (b) und Gruppe 2 (c), die Präferenzen für Wechselwirkungen mit Y- (b) bzw. W- und Y-Resten (c) veranschaulichen.

Die beiden W-Reste und Y88 von p27 sind im verwandten Regulationsprotein für den gestörten Zellzyklus, p21Waf1/Cip1 42 (p21; Abb. 8a), konserviert, sodass ihre Dominanz bei Wechselwirkungen mit Verbindungen der Gruppen 1 und 2 weiter getestet werden kann (Abb. 8b). ,C). Die Verbindung der Gruppe 2, SJ403, interagierte mit Resten in der Nähe von W49 und W65 von p21 (innerhalb der p21-Kinase-inhibitorischen Domäne, p21-KID), jedoch nicht mit Y77 (homolog zu Y88 von p27; Abb. 8c), was die Bedeutung von W-Resten unterstützt für Wechselwirkungen mit diesem kleinen Molekül, legt aber auch nahe, dass für zusätzliche Wechselwirkungen die Clusterbildung von mindestens zwei Y- und F-Resten erforderlich ist. Die beiden Leucin (L)-Reste, die Y77 in p21 flankieren (L76 und L78), ersetzen nicht F87 und Y89 in p27. Ebenso unterstützt die L76YL78-Region von p21 die Bindung an eine Verbindung der Gruppe 1 nicht (SJ319843; Abb. 8b). Diese Erkenntnisse mit p21-KID untermauern unsere Erklärung der molekularen Basis für Wechselwirkungen von Verbindungen der Gruppen 1 und 2 mit p27 weiter.

Interaktion von p21-KID mit repräsentativen p27-Fragmenttreffern.

(a) Vergleich der Aminosäuresequenzen der D2-Subdomänen von p27-KID und p21-KID; (b,c) Einzelne Störungen der chemischen Verschiebung von 1H (ΔδHN) (durch Analyse von 2D-1H-15N-HSQC-NMR-Spektren), verursacht durch die Zugabe von SJ319843 (b, Gruppe 1) bzw. SJ403 (c, Gruppe 2) zu 2H/ 15N-p21-KID (20 μM). Der Schwellenwert für die Identifizierung spezifischer Bindungswechselwirkungen mit den p27-KID-Resten wurde als zwei Standardabweichungen über dem Durchschnitt der Störungen der chemischen Verschiebung (Δδave+2σ, dargestellt als gepunktete schwarze Linie) definiert und berücksichtigt, wenn die Störungen größer als die experimentelle digitale 1H-Auflösung waren (dargestellt als gepunktete magentafarbene Linie).

Um Einblicke in die Strukturmerkmale der Bindungsstellen für kleine Moleküle in p27 zu erhalten, führten wir Molekulardynamiksimulationen (MD) (über 400 ns) mit p27-D2 durch. Die Ergebnisse rekapitulierten frühere MD-Befunde (über 100 ns) für das längere p27-KID-Konstrukt21, die eine vorübergehende β-Haarnadel mit den Resten W60-F64 und H67-L70 (innerhalb der Unterregion D2.1) und zwei beteiligte α-helikale Windungen zeigten Reste E80-G82 und F87-Y89 (innerhalb der Unterregion D2.3). In der neuen MD-Flugbahn waren diese Sekundärstrukturen auf kurzen Nanosekunden-Zeitskalen stabil, entfalteten sich jedoch über die in diesem Experiment untersuchten längeren Zeiträume und falteten sich wieder. Diese Übergänge auf längerer Zeitskala waren mit der vorübergehenden Bildung hydrophober Cluster verbunden, an denen Reste in den Unterregionen D2.1 und 2.2 (enthaltend W60 und W76) und der Unterregion D2.3 (enthaltend Y88; Abb. 9a) beteiligt waren ausgedehnte und kompakte Konformationen (in Abb. 9b mit E und C gekennzeichnet). Repräsentative erweiterte und kompakte Konformere sind in Abb. 9c bzw. d dargestellt, alle anderen in Suppl. Abb. 10a,b. (Beachten Sie, dass Konformere als kompakt definiert werden, wenn zwei der drei aromatischen Reste von p27, die für die Bindung an kleine Moleküle entscheidend sind, W60, W76 und Y88, weniger als 20 Å voneinander entfernt sind.) Wir spekulieren, dass die ausgedehnten und kompakten Konformationen eine Bindung bewirken Stellen für Verbindungen der Gruppe 1 bzw. Gruppe 2. Unsere Interpretation dieser Ergebnisse ist, dass Verbindungen der Gruppe 1 an das F87YY89-Motiv innerhalb der Unterregion D2.3 in p27-D2-Molekülen binden, in denen Y88 weit von W60 und W76 entfernt ist (>20 Å), und dass Moleküle der Gruppe 2 an Compact binden Konformationen, wenn mindestens zwei der drei kritischen aromatischen Reste innerhalb der verschiedenen Unterregionen (Unterdomänen D2.1, D2.2 und D2.3) geclustert sind. Interessanterweise zeigte die Analyse der MD-Trajektorie, dass Y88 und entweder W60 oder W76 häufig in engem Kontakt standen, alle drei Reste jedoch selten in unmittelbarer Nähe waren (Suppl. Abb. 10c). Dies deutete darauf hin, dass es mehrere unterschiedliche Konformationen mit geclusterten aromatischen Resten (insbesondere Y88 und entweder W60 oder W76) gibt, die an Verbindungen der Gruppe 2 binden können, was mit Mutageneseergebnissen übereinstimmt, die zeigen, dass entweder W60 oder W76, aber nicht beide, für die Gruppe entbehrlich sind 2-Verbindungsbindung (Suppl. Abb. 5a – f). Zusammenfassend deuten die neuen MD-Ergebnisse für p27-D2 stark darauf hin, dass vorübergehende Konformationsschwankungen, die Cluster aromatischer Reste erzeugen und zerstören, die Bindung kleiner Moleküle der Gruppen 1 und 2 an p27-D2 modulieren. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Identifizierung von W60, W76 und Y88 durch NMR als Hauptstellen für die Bindung von Verbindungen und mit Ergebnissen, die zeigen, dass die Bindung durch Mutation dieser Reste verändert wird.

Abstandsprofile von W60-, W76- und Y88-Cβ-Atomen, die als Funktion der Zeit anhand von MD-Simulationen überwacht wurden, zeigen ausgedehnte und kompakte Zustände im p27-D2-Konformationsensemble.

(a) Abstand zwischen W60-W76 (links), W60-Y88 (Mitte) und W76-Y88 (rechts) Cβ-Atomen, überwacht über die Zeit von MD aus, wobei graue Linien den momentanen Abstand (alle 2 ps) und rote Linien die Zeit darstellen Durchschnitt (jede ns). Die Zeiten, zu denen repräsentative erweiterte (E) und kompakte (C) Konformere zur Anzeige in Suppl extrahiert wurden. Abb. 10 sind angegeben. (b) Darstellung der Verteilungen der Abstände in (a), dargestellt als Histogramme (rote Linien). Die Verteilungen zeigen die Existenz von zwei unterschiedlichen Zuständen für W60-Y88 (Mitte) und W76-Y88 (rechts), was auf kompakte (C) und erweiterte (E) Konformationen hinweist (siehe Suppl. Abb. 10). (c,d) Repräsentative erweiterte (c) bzw. kompakte (d) Konformationen, die die relativen Positionen der Reste von p27-D2 zeigen, die an der Interaktion mit Fragmenttreffern beteiligt sind.

Die Entdeckung von Arzneimitteln gegen gefaltete Proteine erfordert oft die Identifizierung von Verbindungen, die an Stellen binden, die natürlicherweise für Wechselwirkungen mit kleinen Molekülen oder makromolekularen Liganden genutzt werden. Solche Bindungsstellen sind zeitlich stabil und ermöglichen spezifische und enge Wechselwirkungen mit chemisch komplementären kleinen Molekülen. Im Gegensatz dazu weisen ungeordnete Proteine (oder ungeordnete Proteinregionen) dynamische und heterogene Konformationen auf, die keine ähnlichen, zeitlich stabilen Bindungsstellen für kleine Moleküle aufweisen. Trotz des Mangels an zeitlich stabilen Merkmalen interagieren jedoch viele ungeordnete Proteine/Regionen mit makromolekularen Partnern durch den Prozess der Faltung bei der Bindung. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Fähigkeit eines ungeordneten Proteins, andere Proteine zu binden, auch die Fähigkeit verleihen würde, kleine Moleküle zu binden, und testeten diese Idee durch die hier beschriebenen Studien zu p27.

Das gesamte p27-Protein ist ungeordnet und seine N-terminale Domäne (p27-KID) wird durch die Bindung an Cdk2/Cyclin A geordnet. Ein kurzes lineares Motiv innerhalb der D1-Subdomäne von p27-KID (mit der Sequenz R30NLFG34; L, Leucin ; Suppl. Abb. 11a,b) bindet an eine Tasche auf der Oberfläche von Cyclin A. Die Subdomäne LH, die die Subdomänen D1 und D2 verbindet, kontaktiert die Oberflächen von Cyclin A und Cdk2, trägt aber wenig zur Bindungsenergie bei43. Die Subdomäne D2 von p27 (p27-D2; 34 Aminosäuren lang) nimmt eine umfangreiche Sekundärstruktur an und geht bei der Bindung umfangreiche hydrophobe Wechselwirkungen mit Cdk2 ein (Suppl. Abb. 11a, c und d). Darüber hinaus bilden sich zahlreiche Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Resten innerhalb der D2-Subdomäne und Cdk2. Während p27-D2 11 hydrophobe und aromatische Reste aufweist (einschließlich I-, L-, V-, F-, W- und Y-Reste), von denen viele zu Wechselwirkungen mit Cdk2 beitragen, bildet diese Unterdomäne nicht unabhängig einen stabilen hydrophoben Kern.

Trotz umfangreicher Unordnung im ungebundenen Zustand identifizierten wir zwei Gruppen kleiner Moleküle, die mit hervorragender Spezifität, wenn auch mit geringer Affinität, an zwei überlappende Regionen innerhalb von p27 banden. Diese Moleküle binden an Regionen, die aromatische Ringe enthalten, wobei W- und Y-Reste bevorzugt werden. Moleküle in Gruppe 1 banden an eine lokalisierte Region, F87YY89, während Moleküle in Gruppe 2 an diese Region sowie zwei weitere, die zwei W-Reste enthielten (W60 und W76), banden. Bemerkenswerterweise waren die Moleküle der Gruppen 1 (25 Moleküle) und 2 (14 Moleküle) chemisch ähnlich und zeigten chemische Struktur-Bindungsaktivitätsbeziehungen für diese beiden Arten kleiner Moleküle: Proteininteraktionen. Aufgrund des „unscharfen“ Charakters der jeweiligen Interaktionspotentialkarten bezeichnen wir dieses Phänomen als „Fuzzy-Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR)“ (Abb. 3a,b).

Diese chemischen Merkmale der p27-Bindungsmoleküle können auf der Grundlage der Merkmale von Resten innerhalb und neben den NMR-identifizierten Bindungsstellen innerhalb von p27-D2 erklärt werden. Moleküle der Gruppen 1 und 2 wiesen zwei oder drei heterozyklische aromatische Ringe auf und zeigten das Potenzial dieser Ringe, an hydrophoben Wechselwirkungen teilzunehmen (Abb. 3a, b; Goldpolygone). Moleküle in beiden Gruppen zeigten auch das Potenzial, elektropositive Einheiten zu binden (Abb. 3a, b; cyanfarbene Polygone), was damit übereinstimmt, dass die F87YY89-Region in den Bindungsstellen der Gruppe 1/2 am C-terminalen Ende von R90PPR93 und W60 flankiert wird Die Bindungsstelle der Gruppe 2 wird am N-terminalen Ende von R58K59 flankiert. Der Rest W76 innerhalb der Bindungsstelle der Gruppe 2 wird von Aminosäuren mit elektronegativen und elektropositiven sowie polaren Merkmalen flankiert (E71GKYEW76QEVEK81), obwohl das Potenzial für Wechselwirkungen mit elektronegativen Einheiten nur schwach dargestellt war (Abb. 3b; rote Polygone). Zusätzlich zu den elektrostatischen Eigenschaften können die kleinen Moleküle, die Wasserstoffbrückenbindungsdonoren und -akzeptoren aufweisen, durch vorübergehende Wasserstoffbrückenbindungen mit komplementären Gruppen innerhalb von p27-D2 Spezifität erreichen, wie dies bei kleinen Molekülen beobachtet wird, die an Myc44 binden. Wir argumentieren, dass diese und andere derzeit nicht anerkannte Merkmale der p27-D2-Polypeptidkette das Potenzial schaffen, kleine Moleküle der Gruppen 1 und 2 spezifisch zu binden.

Was sind die Konformationsmerkmale der Bindungsstellen für kleine Moleküle in p27? Unsere MD-Berechnungen mit p27-D2 ergaben dynamische Schwankungen der paarweisen Abstände zwischen den aromatischen Resten (insbesondere W60, W76 und Y88) innerhalb der Bindungsstellen der Gruppe 2 (Abb. 9). Während W60 und W76 einen relativ schmalen Abstandsbereich abtasteten (16,5 ± 2,3 Å), schwankten die Abstände zwischen W60 und Y88 und W76 und Y88 über einen größeren Bereich (20,5 ± 5,5 Å bzw. 19,6 ± 4 Å). Darüber hinaus zeigten diese letzteren Restpaarabstände jeweils zwei diskrete Populationen, die wir als kompakt (C) und erweitert (E; Abb. 9b, mittlere und rechte Tafel) bezeichnen. Wir schlagen vor, dass die kompakten Konformationen Bindungsstellen für Verbindungen der Gruppe 2 schaffen, was mit den NMR-CSP-Mustern übereinstimmt (Abb. 7c). Darüber hinaus schlagen wir vor, dass erweiterte Konformationen die Bindung von Verbindungen der Gruppe 1 an die F87YY89-Region begünstigen, was auch mit NMR-CSP-Mustern übereinstimmt (Abb. 7b). W60 wird von F62 und F64 und W76 von Y74 flankiert, aber Mutageneseergebnisse (Suppl. Abb. 5a – f) legen nahe, dass die W-Reste die Hauptdeterminanten für die Bindung von Verbindungen der Gruppe 2 sind. Dies ist wahrscheinlich auf das Potenzial der Seitenketten von W- und Y-Resten (aber nicht von F-Resten) zurückzuführen, neben der Teilnahme an hydrophoben und π-Stapelwechselwirkungen auch Wasserstoffbrückenbindungen mit kleinen Molekülen zu bilden. Interessanterweise zeigte die Distanzkorrelationsanalyse (Suppl. Abb. 10c), dass Y88 in den kompakten Konformationen am häufigsten in der Nähe von W60 oder W76 liegt, selten jedoch in der Nähe beider W-Reste. Dies deutete darauf hin, dass die enge Nähe von Y88 und dem einen oder anderen der beiden W-Reste Bindungsstellen innerhalb von p27-D2 für Verbindungen der Gruppe 2 schuf. Diese Beobachtung steht auch im Einklang mit Mutageneseergebnissen, die zeigten, dass die Mutation beider W-Reste, jedoch nicht einzelner W-Reste, die Bindung an Verbindungen der Gruppe 2 aufhob (Suppl. Abb. 5c, f gegenüber a, b, d, e). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass p27-D2 vorübergehend enge Kontakte zwischen W60 oder W76 und Y88 aufwies, was unserer Meinung nach Bindungsstellen für Verbindungen der Gruppe 2 schafft. Wenn außerdem weder der W-Rest noch der Y88 nahe beieinander liegen, entstehen durch die räumliche Nähe der drei aromatischen Reste in der F87YY89-Region Bindungsstellen für Verbindungen der Gruppe 1. Es ist interessant, dass in der Cdk2/Cyclin A-gebundenen Struktur von p27-KID34 die fünf aromatischen Reste in den Unterregionen D2.1 und D2.2 (die an Verbindungen der Gruppe 2 binden) in unmittelbarer Nähe (aber getrennt von ihnen) liegen die F87YY89-Region; Suppl. Abb. 11a, c und d). Die MD-Ergebnisse zeigen, dass in Abwesenheit von Cdk2/Cyclin A Teilmengen dieser acht aromatischen Reste vorübergehend interagieren und manchmal Bindungsstellen für verschiedene Arten heterozyklischer aromatischer kleiner Moleküle (Gruppe 1 oder 2) schaffen.

Es wurde gezeigt, dass die Verbindung SJ403 p27-D2 von Cdk2/Cyclin A trennt und die katalytische Aktivität von Cdk2 aktiviert, wodurch unser Ziel, die Zellzyklus-Hemmfunktion von p27 zu hemmen, effektiv erreicht wird. Während die Affinität der Moleküle der Gruppen 1 und 2 gering ist, weisen sie eine hohe Spezifität für bestimmte Regionen von p27 auf. Wie oben erläutert, greifen Reste in diesen Regionen ansonsten an Cdk2. Bemerkenswerterweise gelang es den >2.300 untersuchten Verbindungen nicht, andere Regionen von p27 (Subdomänen D1 und LH) zu binden, was darauf hindeutet, dass diesen anderen Regionen eine ausreichende Dichte aromatischer Reste (insbesondere W- und Y-Reste) fehlt, um kleine Heterocyclen spezifisch zu erkennen aromatische Moleküle. Die Subdomäne LH bindet isoliert nicht an Cdk2/Cyclin A, aber die Subdomäne D1 bindet Cyclin A mit hoher Affinität (Kd, 42 nM)45. Wir spekulieren, dass das RxLFG-Motiv in dieser letztgenannten Region aufgrund seiner begrenzten Länge keine Konformationen annehmen kann, die Bindungstaschen für kleine Moleküle schaffen, wie dies für die viel längere D2-Subdomäne möglich ist. Allerdings schränkt die geringe Affinität der Verbindungen der Gruppen 1 und 2 für p27 ihre Anwendbarkeit für unser umfassenderes Ziel ein, die p27-Funktion in Zellen und letztlich auch beim Menschen zu modulieren. Wie kann die Affinität kleiner Moleküle zu p27 erhöht werden? Wir schlagen vor, dass die Moleküle der Gruppen 1 und 2 eine gewisse Konformationseinschränkung innerhalb von p27-D2 verursachen und dass Moleküle, die diese Einschränkung verstärken, eine höhere Affinität aufweisen. Wir gehen davon aus, dass kleine Moleküle mit größerer „Dreidimensionalität“, die chemisch vielfältige und komplexe Merkmale aufweisen, bessere Vorlagen für die Bindung und Sequestrierung von p27 sein werden. Derzeit laufen Bemühungen, die auf zwei Strategien basieren, um unsere Fragmenttreffer mithilfe synthetischer Chemie zu optimieren. Erstens „züchten“ wir die Gerüste der Gruppen 1 und 2, indem wir verschiedene chemische Einheiten an verschiedenen Positionen der heterozyklischen Ringsysteme einführen, um zusätzliche Wechselwirkungen mit Resten in der Nähe von W60, W76 und Y88 in p27-D2 zu ermöglichen. Zweitens werden wir nach Abschluss der Wachstumsexperimente die optimalen Gruppe-1- und Gruppe-2-Moleküle synthetisch „verknüpfen“, um die Bindung an p27-D2 weiter zu verbessern. Die Ergebnisse dieser zukünftigen Experimente werden Aufschluss darüber geben, ob synthetische Strategien zur Verbindungsoptimierung, die aus der strukturbasierten Wirkstoffforschung hervorgegangen sind, auf ein ungeordnetes Protein angewendet werden können. Zusammenfassend haben wir kleine Moleküle mit „Fuzzy-SAR“ entdeckt, die die spezifische Bindung an und die Hemmung von p27 vermitteln, was das Potenzial demonstriert, gestörte Proteinziele in Zukunft rational zu „medikamentieren“.

Die p27-Konstrukte wurden in E. Coli mit einem N-terminalen 6xHis-Affinitätstag nach Subklonierung in pET28a (Novagen) unter Verwendung etablierter Verfahren exprimiert20. Dazu gehörten p27-KID (Reste 22–105 von menschlichem p27) und die folgenden Mutanten: W60A, W60F, W76A, W76F, W60A-W76A, W60F-W76F, F87A, Y88A, Y89A und R90A. p27-D2 (Reste 58–105 von menschlichem p27) und die Mutante C99S-R93C wurden ähnlich exprimiert. Isotopenmarkierte Proteine (15N, 13C/15N und 2H/13C/15N) wurden in einem MOPS-basierten Minimalmedium unter Verwendung etablierter Verfahren exprimiert22. Alle p27-Konstrukte wurden durch Nickel-Affinitätschromatographie gereinigt, mit Thrombin verdaut, um den 6xHis-Tag zu entfernen, und mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer C4-Säule (Vydac) und 0,1 % trifluoressigsäurehaltigem Wasser/Acetonitril-Lösungsmittel weiter gereinigt System. Die Proteinkonzentrationen wurden durch UV-Absorption bei 280 nm unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten von 15.470 M−1 cm−1 für p27-KID, p27-KID-F87A, p27-KID-R90A, p27-D2 und p27-D2-C99S bestimmt. R93C; 13980 M−1cm−1 für p27-KID-Y88A und p27-KID-Y89A; 9.970 M−1 cm−1 für p27-KID-Varianten mit einem einzelnen Tryptophanrest; und 4.470 M−1 cm−1 für p27-KID-Varianten ohne Tryptophanrest. Menschliches Cdk2 in voller Länge, aktives Cdk2 (phosphoryliert an Threonin 160), verkürztes menschliches Cyclin A (Reste 173–432) und p21-KID wurden unter Verwendung etablierter Protokolle exprimiert und gereinigt20,46.

Der Cdk2/Cyclin A-Komplex wurde durch Äquilibrieren von Cdk2 und Cyclin A (Molverhältnis 1:1) für 1 Stunde bei 4 °C und anschließende Reinigung mittels Größenausschlusschromatographie (S75-Harz, GE Healthcare, Piscataway, NJ) in Puffer mit 20 % hergestellt mM Tris, pH 7,5, 200 mM NaCl, 5 mM TCEP). Der ternäre Komplex wurde durch Äquilibrieren von 2H/13C/15N-p27-D2 mit Cdk2/Cyclin A (Molverhältnis 1,1:1) bei 4 °C über Nacht und anschließende Reinigung mittels Größenausschlusschromatographie (S200-Harz, GE Healthcare, Piscataway, NJ) hergestellt ) im gleichen Puffer wie der Cdk2/Cyclin A-Komplex. Für NMR-Experimente wurde der 2H/13C/15N-p27-D2/Cdk2/Cyclin A-Komplex in 20 mM Na-Phosphat, pH 6,5, 200 mM NaCl, 10 mM DTT-D10 und 10 % 2H2O gepuffert.

Die zum Screening auf Bindung an p27-KID verwendete Fragmentbibliothek bestand aus zwei Sammlungen, die nach unterschiedlichen Kriterien entworfen wurden: (a) 1.100 Fragmente wurden von der Maybridge Ro3 Diversity Fragment Library („Maybridge“)47 und (b) 1.222 erworben Fragmente wurden von Enamine (N = 250) und Life Chemicals (N = 972) unter Verwendung eines internen Algorithmus („In-House“) gekauft.

Die Maybridge-Fragmentsammlung wurde entwickelt, um eine breite Abdeckung des chemischen Raums für die fragmentbasierte Arzneimittelentwicklung zu bieten. Jedes Fragment erfüllt die Dreierregel von Congreve40: (a) Molekulargewicht < 300; (b) Anzahl der Wasserstoffbrückendonoren ≤ 3; (c) Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungsakzeptoren ≤ 3; und (d) clogP ≤ 3. Alle Verbindungen haben eine experimentell bestimmte Gleichgewichtslöslichkeit von ≥200 mM (DMSO) und ≥1 mM (PBS) und eine bestätigte Reinheit von ≥95 % (basierend auf der Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie) und sind frei von Reaktivstoffen oder toxische funktionelle Gruppen. Die 1.100 Fragmente bilden einen „Kern“-Satz, der die chemische Vielfalt der gesamten Sammlung (1.823 Fragmente) umfasst.

Die interne Fragmentsammlung besteht aus 1.222 im Handel erhältlichen Verbindungen, die mithilfe eines benutzerdefinierten Algorithmus ausgewählt wurden, der darauf ausgelegt ist, strukturell komplexe Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht und Gerüsten zu identifizieren, die in der separaten Hochdurchsatz-Screening-Bibliothek von St. Jude (HTS-Bibliothek, >500.000 Verbindungen; siehe unten). Zunächst wurden kommerzielle Fragmentsammlungen (Teilmengen größerer Diversitätssammlungen, die nach „fragmentähnlichen“ Merkmalen gefiltert wurden) gefiltert, um Moleküle zu entfernen, die anorganische Atome, Isotope oder ungültige Strukturen enthalten, und um Moleküle zu entfernen, die nicht in ausreichender Menge verfügbar waren (<50 mg). . Vorbeiziehende Moleküle wurden mit Pipeline Pilot (Komponente „Generate Fragments“ in Accelrys v. 8.5 mit erhaltenen Alpha-Atomen, siehe Lit. 48 für die allgemeine Methode) zu Murcko-Gerüsten abstrahiert. Diese Gerüste wurden nach folgenden Regeln weiter gefiltert: Anzahl der reaktiven Substrukturen = 0 („REOS“-Filter49,50,51, Anzahl der drehbaren Bindungen <= 3, Anzahl der schweren Atome >= 10, Anzahl der Ringe >= 1 und Anzahl der Ringsubstitutionen >1 für Einzelringsysteme und Anzahl der in der St. Jude HTS-Bibliothek vorhandenen Moleküle, die das Gerüst enthalten, >= 8. Moleküle, die diese Gerüste enthalten, wurden in den kommerziellen Fragmentbibliotheken identifiziert und dann für den Kauf entsprechend der höchsten Oprea-Komplexität priorisiert52 Diese Bibliothek hat die folgenden durchschnittlichen berechneten physikalisch-chemischen Eigenschaften: MW = 246 ± 39 Da, Anzahl der Atome = 17 ± 3, log P = 1,7 ± 1,0, polare Oberfläche = 63 ± 19 Å2, Anzahl der H-Brücken-Akzeptoren = 4,3 ± 1,4 und Anzahl der H-Brückendonoren = 1,3 ± 0,9. Die Verteilungen dieser und anderer chemischer Merkmale der beiden Fragmentbibliotheken sind in Suppl. Abb. 12a zusammengefasst.

Konsensfeldkarten für Moleküle der Gruppen 1 und 2 wurden mit dem FieldTemplater-Modul in Forge (v10, Cresset, REF= http://www.cresset-group.com/products/forge/accessedDec2014) definiert. Das FieldTemplater-Modul nimmt als Eingabe eine Reihe von Referenzmolekülen (die aktiven Verbindungen für die Gruppen 1 und 2, die in den ersten beiden Screening-Runden identifiziert wurden; ergänzende Tabelle 1A, B) und versucht, diese auszurichten, um die Überlappung zwischen ihren Interaktionsfeldern zu maximieren . Referenzmoleküle werden zunächst mithilfe von Feldpunkten ausgerichtet, gefolgt von einer langsameren, genaueren Optimierung der Ausrichtung unter Verwendung des vollständigen Wechselwirkungsfelds. Vor der Ausrichtung wurden Konformationen mithilfe der Konformationssuchoption „Sehr genau und langsam“ in Forge und den Standardeinstellungen generiert. Die im Alignment verwendete Ähnlichkeitsbewertungsfunktion basierte auf 100 % Feldähnlichkeit und 0 % Formähnlichkeit, um die topologische Diversität der mithilfe des Modells in der nächsten Screening-Runde ermittelten Moleküle zu maximieren.

Die Konsensfeldkarten für Moleküle der Gruppen 1 und 2 wurden verwendet, um eine Datenbank mit 10.455 fragmentähnlichen Molekülen von ChemDiv (www.chemdiv.com) mithilfe des FIeldScreen-Moduls in Forge abzufragen. Von den 215 Molekülen mit den höchsten Feldähnlichkeitswerten wurden 184 Verbindungen gekauft. Allerdings waren 106 davon unter unseren Testbedingungen schlecht löslich und wurden nicht untersucht. Von den verbleibenden 78 Verbindungen wurden 12 zusätzliche Treffer mittels 2D 1H-15N HSQC-NMR identifiziert (siehe unten).

Screening- und Validierungs-NMR-Experimente wurden bei 298 K (25 °C) entweder mit einem Varian Inova 600 MHz-Spektrometer, ausgestattet mit einer Triple Resonance (HCN)-Raumtemperaturgradientensonde, oder einem Bruker Avance 600 MHz-Spektrometer, ausgestattet mit einer kryogenen TCI-Gradientensonde und einem, durchgeführt SampleJet-Probenwechsler. Fragmentmoleküle wurden zunächst als Pools von fünf Molekülen analysiert, die jeweils bei 10 mM in DMSO-D6 gelöst waren. Die in 96-Well-Platten enthaltenen Fragmentpools wurden unter Verwendung eines Gilson 215 Liquid Handler mit Puffer (20 mM Na-Phosphat, pH 6,5, 20 mM NaCl, 10 % 2H2O, 5 mM DTT-D10) oder Puffer, der das p27-KID-Protein enthielt, gemischt (10 μM p27-KID), um Endkonzentrationen der Verbindungen von jeweils 200 μM zu ergeben. Für erste Fragment-Screening-Experimente wurden eindimensionale (1D) 1H- und WaterLOGSY35-NMR-Spektren für Verbindungspools ohne und mit Protein aufgezeichnet. Pools mit Treffern wurden durch Analyse reiner Verbindungen mit 1D 1H entfaltet und durch zweidimensionale (2D) heteronukleare NMR-Experimente (2D 1H-15N HSQC-Titrationen) mit dem Bruker Avance 600 MHz-Spektrometer validiert. Für 2D 1H-15N HSQC-Titrationen verwendete NMR-Proben enthielten 100 μM 15N-markiertes p27-Protein (p27-KID, p27-KID-Mutanten oder p27-D2) in 20 mM Na-Phosphat, pH 6,5, 200 mM NaCl, 10 % 2H2O. 5 mM DTT-D10; In DMSO-D6 gelöste Verbindungen wurden auf die gewünschten Konzentrationen titriert. DMSO-D6 wurde hinzugefügt, um eine konstante Konzentration aufrechtzuerhalten (2 % Vol/Vol). In den Dimensionen 1H und 15N wurde eine spektrale Auflösung von 3,5 bzw. 5,7 Hz erreicht. Tryptophan bzw. Tyrosin wurden in 15N-p27-KID (100 μM) bis zu 3 mM titriert. Dreidimensionale (3D) Backbone-Triple-Resonance-Experimente zur Ermittlung von Resonanzzuordnungen für die p27-Konstrukte wurden mit dem Bruker Avance 600 MHz-Spektrometer durchgeführt. Zuweisungen für p27-KID und p27-D2 sind in Suppl dargestellt. Abb. 12b,c bzw. d,e. 2D-1H-15N-TROSY-HSQC-NMR-Experimente mit 2H/13C/15N-p27-D2/Cdk2/Cyclin A und SJ403 wurden bei 308 K (35 °C) aufgezeichnet. 2D-1H-15N-HSQC-Experimente repräsentativer Fragmenttreffer (1 mM von SJ319843, Gruppe 1 bzw. SJ403, Gruppe 2) mit 15N-p21-KID (20 μM) wurden bei 298 K mit einem Bruker Avance 600 MHz-Spektrometer aufgezeichnet. NMR-Spektren wurden mit der Bruker Topspin-Software verarbeitet und mit der CARA-Software (Computer Aided Resonance Assignment)53 analysiert.

Störungen der chemischen Verschiebung werden im Allgemeinen als kombinierte chemische Verschiebungswerte für 1H und 15N quantifiziert. Die Analyse der Primärdaten für kleine Moleküle, die an p27 binden, zeigte jedoch, dass die größten CSPs für die 1H-Dimension vorlagen, die statistisch signifikant waren, und dass die entsprechenden 15N-CSP-Werte oft klein und nicht signifikant waren. Somit würde die Verwendung kombinierter chemischer Verschiebungswerte die Auswirkungen der Verbindungsbindung maskieren. Wir haben auch die Größe von CSPs im Verhältnis zur experimentellen digitalen Auflösung der 1H- und 15N-Dimensionen von HSQC-Spektren und einem Schwellenwert, der als durchschnittlicher CSP-Wert plus zweifache Standardabweichung des Mittelwerts (Δδave + 2σ) definiert ist, genau berücksichtigt. Daher basierte die Bewertung der statistischen Signifikanz darauf, ob ein bestimmter CSP-Wert größer war als i) die experimentelle spektrale Auflösung in der gegebenen Dimension (1H oder 15N) und ii) die Größe Δδave + 2σ für diese Dimension.

Sechzehn Punkttitrationen repräsentativer Fragmenttreffer aus Gruppe 1 und Gruppe 2 (SJ572710 bzw. SJ572403) in 15N-p27-KID (100 μM) wurden unter Verwendung eines übernommenen „in-phase“ 2D 1H-15N HISQC mit Protonenentkopplung während 15N aufgezeichnet Markierung der chemischen Verschiebung, erreicht mit einem WALTZ16-Kompositimpuls mit einer Amplitude von 7,1 kHz54,55. Alle Experimente wurden mit einem Bruker Avance 800 MHz-Spektrometer durchgeführt, das mit einer kryogenen TCI-Gradientensonde ausgestattet war. Die folgenden Molverhältnisse von 15N-p27-KID (100 μM) zu Inhibitor wurden verwendet: 1:0, 1:0,1, 1:1,5, 1:3, 1:4,5, 1:6, 1:7,5, 1:9 , 1:10,5, 1:12, 1:15, 1:18, 1:21, 1:24, 1:27 und 1:30. Jedes Spektrum wurde mit 256 (t1,max = 31,0 ms) und 1024 (t2,max = 106,5 ms) komplexen Punkten in den 15N- bzw. 1H-Dimensionen aufgezeichnet, wobei pro Punkt acht Transienten erfasst wurden. Die spektrale Auflösung der 1H- und 15N-Dimensionen betrug 2,4 bzw. 1,7 Hz. Störungen der chemischen Verschiebung während der gesamten Titration mussten größer als diese Auflösungsschwelle sein, um für die weitere Analyse berücksichtigt zu werden. Die Daten wurden mit dem NMRPipe-Paket56 verarbeitet und mithilfe interner Skripte analysiert, die in Python unter Verwendung der Scipy-Computerbibliotheken und Mathematica (Wolfram Research) geschrieben wurden. Um menschliche Vorurteile bei der Bestimmung der Peakposition zu verringern, wurde die automatische Peakauswahlfunktion in NMRpipe genutzt, bei der jeder Resonanz über die gesamte Titrationsbahn für eine gegebene chemische Verschiebung ein Spektralfenster zugewiesen wurde. Der Fehler in der Spitzenposition für eine gegebene Resonanz wurde als 15N- oder 1HN-Linienbreite dividiert durch das Signal-Rausch-Verhältnis angenommen. Alle Resonanzen, die Störungen der chemischen Verschiebung zeigten, die größer als die spektrale Auflösung und Δδave + 2σ waren, wurden anschließend gruppiert und global für ihre jeweilige maximale chemische Verschiebungsdifferenz und eine globale Dissoziationskonstante (Kd) angepasst. Der Fehler in den Kd-Werten wurde mithilfe eines Monte-Carlo-Ansatzes bestimmt, bei dem der Ligandenkonzentration ein Fehler von 10 % auferlegt und der Fehler in der Peakposition der chemischen Verschiebung berücksichtigt wurde.

Der p27-D2-C99S-R93C-Mutant wurde mit Alexa Fluor488-C5-Maleimid (Life Technologies, p27-D2-FL) in Puffer konjugiert, der 20 mM Na-Phosphat, pH 7,3, 20 mM NaCl gemäß dem Protokoll des Herstellers enthielt. Das konjugierte Protein wurde durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer C4-Säule (Vydac) und eines 0,1 % Trifluoressigsäure enthaltenden Wasser/Acetonitril-Lösungsmittelsystems weiter gereinigt. Lyophilisierte HPLC-Fraktionen wurden in Puffer resuspendiert, der 20 mM Na-Phosphat, pH 7, 200 mM NaCl und 3,5 mM TCEP enthielt. Fluoreszenzanisotropiemessungen wurden bei 25 °C mit einem Horiba Fluorolog 3-Spektrofluorometer durchgeführt. Kurz gesagt, p27-D2-FL (20 nM) wurde mit Cdk2/Cyclin A (300 nM) gemischt und zur erforderlichen Menge der lyophilisierten Verbindung (SJ403) hinzugefügt. Alle Proben wurden vor den Fluoreszenzmessungen über Nacht im Dunkeln bei 4 °C inkubiert. Die Bindungsdaten der Fluoreszenzanisotropie wurden mit KaleidaGraph analysiert. Die Kurvenanpassung wurde anhand des Durchschnitts von drei unabhängigen Experimenten mithilfe eines nichtlinearen Regressionsbindungsmodells durchgeführt.

Cdk2/Cyclin A (200 pM) wurde mit Histon H1 (15 μM; EMD Millipore), p27-D2 (200 nM) und unterschiedlichen Mengen lyophilisiertem SJ403 gemischt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Wirkung der SJ403-Verbindung auf die Cdk2-Aktivität wurde durch die Durchführung ähnlicher Experimente in Abwesenheit von p27-D2 bestimmt. Anschließend wurde ATP (50 μM Gesamtkonzentration, davon 6 μCi γ 32P-ATP (PerkinElmer, Inc)) zu jeder Reaktion gegeben und weitere 35 Minuten bei 30 °C inkubiert. Jede Reaktion hatte ein Gesamtvolumen von 20 μL. Der Probenpuffer enthielt 20 mM HEPES pH 7,3, 25 mM Natrium-β-glycerolphosphat, 15 mM MgCl2, 16 mM EGTA, 0,5 mM Na3VO4 und 10 mM DTT. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von SDS-Gelladepuffer (5 μl) gelöscht und dann durch SDS-PAGE (10 μl) analysiert. Die Gele wurden bei 70 °C unter Vakuum getrocknet und ein Phosphoimager (GE Healthcare, Piscataway, NJ) wurde zur Quantifizierung der 32P-Histon-H1-Banden verwendet. Die IC50-Werte wurden durch Kurvenanpassung mit der KaleidaGraph-Software bestimmt. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt und der mittlere IC50-Wert sowie die Standardabweichung der Mittelwerte werden angegeben.

Zur Untersuchung der Konformationslandschaft der p27-D2-Domäne wurden Allatom-MD-Simulationen mit der für die Grafikverarbeitungseinheit (GPU) optimierten AMBER 12-Software57 verwendet. Die Konformation von p27-D2 innerhalb der p27-KID/Cdk2/Cyclin A-Struktur (PDB ID, 1JSU) wurde als Ausgangsstruktur aus MD-Berechnungen mit modifizierten Aminosäureprotonierungszuständen verwendet, um pH 7,0 widerzuspiegeln. Die Struktur wurde in eine rechteckige Box mit TIP3P-Wasser gelegt, die an allen Seiten 15 Å größer war als das p27-D2-Molekül. Zusätzlich zur Neutralisierung des Systems durch Zugabe von Gegenionen wurde 20 mM NaCl hinzugefügt, um die experimentellen Bedingungen in unseren Simulationen nachzuahmen.

Das System wurde wie zuvor beschrieben mithilfe einer mehrstufigen Energieminimierung bei 298 K äquilibriert und stabilisiert. Alle Produktionsläufe wurden unter Verwendung des Ensembles mit konstanter Teilchenzahl, Volumen und Energie (NVE) und periodischen Randbedingungen durchgeführt. Für elektrostatische Wechselwirkungen wurde die Partikelnetz-Ewald-Methode (PME) und für Lennard-Jones-Wechselwirkungen ein Grenzwert von 10 Å verwendet. Der SHAKE-Algorithmus wurde verwendet, um die Bewegungen aller kovalent gebundenen Wasserstoffatome einzuschränken. Simulationen wurden bei 298 K und 1 atm Druck durchgeführt. Die Gesamtzeitskala für unsere Simulation betrug 0,4 Mikrosekunden, wobei alle 2 ps Schnappschüsse gespeichert wurden, was zu insgesamt 200.000 Schnappschüssen der Flugbahn führte.

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Die Autoren danken Christy R. Grace für ihre Unterstützung bei NMR-Experimenten, Heather Ross für die Verwaltung der Verbindungsbibliothek und Ariele Viacava Follis für Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der US National Institutes of Health (NIH) R01CA082491 und 1R01GM083159 (an RWK), 2R01DC006471 und 1R21DC013879-01 (an JZ) sowie die Office of Naval Research Grants N000140911014, N000141210191 und N00014121 unterstützt 0775 (an JZ), ein US-amerikanischer Staatsbürger Cancer Institute Cancer Center Support Grant P30CA21765 (im St. Jude Children's Research Hospital) und ALSAC. LII war Empfänger des Garwood Foundation Fellowship des St. Jude Children's Research Hospital. DB möchte sich für die Unterstützung des US-amerikanischen National Institute of General Medical Science (F32GM113290) bedanken.

Kavitha Bharatham

Aktuelle Adresse: Zentrum für chemische Biologie und Therapeutik, Institut für Stammzellbiologie und Regenerative Medizin, GKVK, Bellary Road, Bangalore, 560065, Indien

Abteilung für Strukturbiologie, Memphis, TN, 38105

Luigi I. Iconaru, David Ban, Weixing Zhang und Richard W. Kriwacki

Abteilung für Entwicklungsneurobiologie, Memphis, TN, 38105

Luigi I. Iconaru & Jian Zuo

Abteilung für Chemische Biologie und Therapeutik, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN, 38105

Kavitha Bharatham und Anang A. Shelat

Abteilung für Computational Science and Engineering, Health Data Sciences Institute, Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, 37830

Arvind Ramanathan

Abteilung für Mikrobiologie, Immunologie und Biochemie, University of Tennessee Health Science Center, Memphis, TN, 38163

Richard W. Kriwacki

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LII, DB, AR, WZ, AS, JZ und RWK konzipierten Forschung; LII, DB, KB und AR führten Experimente durch; LII, DB, KB, AR, AS und RWK analysierten Daten; und LII, DB, AR, AS, JZ und RWK haben das Manuskript geschrieben.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Iconaru, L., Ban, D., Bharatham, K. et al. Entdeckung kleiner Moleküle, die das ungeordnete Protein p27Kip1 hemmen. Sci Rep 5, 15686 (2015). https://doi.org/10.1038/srep15686

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Eingegangen: 14. Juli 2015

Angenommen: 25. September 2015

Veröffentlicht: 28. Oktober 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15686

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